丹参是丹参大孔唇形科植物丹参(SalviamiltorhizaBge)的干燥根和根茎。味苦；性微寒。树脂功能主治：通经止痛，优化活血化瘀，工艺凉血消痈，及其究清心除烦。抗疲用于症瘕积聚，劳活胸痹心痛，性研心烦不眠，丹参大孔热痹疼痛，树脂痛经经闭，优化月经不调，工艺疮疡肿痛。及其究丹参的抗疲活性成分有脂溶性成分丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ-A、劳活隐丹参酮和水溶性成分丹参素、原儿茶醛等。其中丹参酮(tanshinone)类作为丹参的主要有效成分，有较强的生理活性以及广泛的药理作用，包括心血管药理作用、天然抗氧化、性激素作用、抗肿瘤作用等。疲劳又称疲乏，是一种主观不适感觉，但客观上会在同等条件下失去其完成原来所从事的正常工作和活动的能力。现在社会加快的生活节奏和增大的社会竞争及家庭压力，使疲劳人群不断增多，且程度更加严重，发生后如果不及时缓解，就会逐渐积累，最终导致机体的神经、内分泌及免疫等系统调节失常，严重的会导致器质性病变，严重影响人身心健康。因此对于抗疲劳药物的研究意义重大。一些文献和专利报道了关于丹参酮的提取分离，但提取方法复杂且成本高，限制了对丹参酮的深入研究。本实验利用大孔树脂对丹参提取物进行分离优化，此方法环保卫生、节约成本。大孔吸附树脂色谱的原理是吸附和分子筛原理相结合。近年来该技术已广泛应用于中药新药研发和中药制剂研发生产中，基本已成为分离中药化学成分的主要手段之一，具有选择性好，吸附速度快，分离处理量大，可再生重复使用节约成本等特点。

一、材料与仪器

1、材料、试剂

丹参根，山东省泰安市化马湾20171121，经山东中医药大学李佳教授鉴定为丹参根；丹参酮标准品HPLC＞=98%，100mg/瓶；无水乙醇，试剂均为分析纯；水为蒸馏水或同等纯度的水；大孔树脂D-290、D-301、D-101、D-201、AB-8。美国洋参冲剂(规格：4g/袋，金日制药有限公司，批号：20170823)。肝糖原测定试剂盒，血乳酸测定试剂盒，血清尿素氮测定试剂盒，上海加科生物科技有限公司。

2、仪器

紫外-可见分光光度计，UV2550，日本岛津公司；HH-S4型数显恒温水浴锅，常州国宇仪器制造有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，郑州南北仪器设备有限公司；TDL-80-2B离心机价上海安亭科学仪器有限公司；YP-B电子天平，上海光正医疗仪器有限公司；YRE-501旋蒸仪，巩义市予华仪器有限公司；Agilent1260型高效液相色谱仪(Agilent1260四元泵，DAD检测器，LC1260色谱工作站)；TC-C18色谱柱(5μm，4.6mmx200mm)；游泳玻璃缸，自制；精密移液器、一次性吸头。

3、实验动物

清洁级昆明小鼠，雄性，体重20g～24g；由北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司提供，生产许可证号SCXK(沪)20012-0005。

二、单因素提取优化工艺

1、丹参提取液的制备(以最佳条件为例)

称取一定量丹参根，用植物粉碎机粉碎，过40目筛。称量200.0g置于2000mL圆底烧瓶中。加入8倍量(1600mL)85%乙醇，水浴锅在70℃下回流提取3h，抽滤，滤液保存，滤渣重新倒入圆底烧瓶，重复以上实验2次后，滤液保存，滤渣废弃。将部分滤液置于圆底烧瓶中，温度设置为50℃，转速为30r/min，进行旋蒸，浓缩滤液至1.3～1.35g/mL。测量浓缩后的滤液体积，向其中加入3倍量热水，将该溶液置于50mL离心：管中进行离心，时间10min，转速4000r/min。离心停止后观察上清液颜色，重复上面步骤至上清液为无色，离心留下沉淀，用药匙将沉淀转移到蒸发皿中。沉淀在60℃水浴锅内蒸干，得到丹参提取物，称量沉淀质量，备用。

2、影响丹参提取液中丹参酮纯度的因素

回流时乙醇浓度、回流时间、回流温度均可影响丹参酮纯度。

回流乙醇浓度确定：75%、85%、95%。

回流温度确定：60℃、70℃、80℃。

回流时间确定：2h、3h、4h。

按照表1条件进行实验。

3、大孔树脂的筛选

（1）树脂的预处理

新树脂首先用3mol/LNaOH浸泡8h，接着用水清洗至中性，再用3mol/L的HCl浸泡8h，用水洗至中性，再用95%乙醇浸泡24h，最后用水洗到树脂无醇味。

（2）大孔吸附树脂型号的选择

准确称取预处理过的大孔树脂各1.0g，分别加入100mL丹参提取液置于250mL锥形瓶中，在水浴摇床(25℃、100～120r/min)上振荡24h，测定吸附平衡后溶液中丹参酮的含量。接着用蒸馏水洗树脂三次来除去表面残留的样液，再加入50mL70%乙醇解吸24h后计算解吸率。以大孔树脂的解析率、吸附率为指标，选择最优的大孔树脂。

吸附能力=(Co-Cv)xV/W

吸附率(%)=(Co-C₁)/Cox100

解析率(%)=(C₂xV₂)/[(Co-C₁)xVo]x100

式中：Co为初始样液浓度，

C₁为平衡浓度，

C₂为洗脱液浓度，

Vo为初始样液体积，

V₂为洗脱液体积，

M为树脂干重。

4、大孔树脂优化丹参酮的条件优化

（1）吸附剂和上样浓度的选择

将8份预处理好的D101大孔吸附树脂湿法装柱，将丹参提取液溶于25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇后上样。考察不同吸附剂对大孔树脂吸附效果的影响。

将5份预处理好的树脂用湿法装柱，蒸馏水充分平衡，然后将浓度分别为2、4、6、8、10mg/mL的丹参提取液以2BV/h的流速上样吸附，每0.5BV的流出液收集1份，测定流出液的丹参酮浓度，绘制泄漏曲线，根据曲线确定上样浓度。

（2）解析液的选择

将粗提物溶于55%乙醇后上样。分别用60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的乙醇进行洗脱，通过薄层色谱检测洗脱液中含有的成分[展开剂为石油醚(60～90℃):丙酮=4:1]，HPLC检测各浓度洗脱液中丹参酮的纯度，确定合适的洗脱剂。

（3）上样流速对解吸效果的影响

将5份预处理好的树脂湿法装柱(30mL)，将50mL提取液经大孔树脂完全吸附后，用150mL，50%的乙醇分别以1、2.3、4、5BV/h的流速上样吸附，计算解析率。考察上样流速对解吸效果的影响。

5、丹参酮纯度的检测

丹参提取液溶于70%乙醇经过D101大孔树脂优化后，得到含有丹参酮的洗脱液。洗脱液通过旋转蒸发仪浓缩脱醇，得到丹参酮粗提液。

高效液相色谱条件：AgilentTC-C18色谱柱(4.6mmx250mm，5μm)，流动相乙腈-水，等梯度洗脱；流速：1.0mL/min；测定波长：250nm；柱温：35℃，进样量10u。

6、抗疲劳试验

（1）动物给药及分组

将100只雄性昆明小鼠(体重20～24g)随机分成五组，每组20只。按照中国药典和《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)，小鼠按照空白组、阳性对照组、丹参酮低剂量组、中剂量组、高剂量组随机分为5组，空白对照组小鼠给予蒸馏水灌胃，阳性对照组给予洋参冲剂250mg/kg。给予丹参酮低剂量(200mg/kg)中剂量(400mg/kg).高剂量(1g/kg)。

（2）负重游泳实验

小鼠按照各剂量组分组，每组20只，按照连续灌胃给药20d，于末次灌胃1h后，在其尾巴根部缠绕自身质量5%的铅块，负重后置于水温为25(±1)℃，水深30cm的塑料箱中，观察其负重游泳情况，纪录小鼠从开始游泳到死亡的时间，即小鼠的负重游泳时间。

7、抗疲劳指标测定

根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)的要求和相关文献进行实验。将小鼠按照各剂量组分组，每组20只，连续灌胃给药20d，末次灌胃30min后，置于水温25(+1)℃、水深30cm的塑料箱中不负重游泳90min后取出擦干。摘取眼球采血，采用试剂盒法测定血清中尿素氮和乳酸的含量，接着处死小鼠，取出肝脏，用试剂盒测定肝糖原含量。

8、数据处理方法

用Excel建立实验数据库，组间比较单因素方差分析。

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